干货：外泌体如何进行药物递送

来源: 阅读： 2021-12-20 16:51:08

[提要]众所周知,EVs 可以装载的药物包括化疗药物和核酸,例如信使 RNA( mRNA), miRNA,小干扰 RNA( siRNA)和小核仁 RNA( snoRNA...

众所周知,EVs 可以装载的药物包括化疗药物和核酸,例如信使 RNA( mRNA), miRNA,小干扰 RNA( siRNA)和小核仁 RNA( snoRNA)。 EVs 的来源,分离方法,标记方法以及给药途径都会影响药物递送。

EVs 药物递送效率评估(发表文献举例):

从生物来源分离出 EVs 后,可以通过物理方法或者化学方法装载药物的方法有:混和、电穿孔、声波、冻融循环、挤压、皂素透化、转染试剂。

基于 EVs 的的癌症治疗药物递送示例

我们解读一篇发表Nanomedicine杂志上《Development of Exosome-encapsulated Paclitaxel to Overcome MDR in Cancer cells》,为表格一中第一篇文献。

本文研究者提出了基于外泌体作为药物运载工具的可能性,从而提高化疗药物紫杉醇对耐药肿瘤细胞的治疗效果。因此,研究者们利用巨噬细胞分泌的外泌体,寻找并比较了各种外泌体运载紫杉醇(exoPTX)的方法,进而对这个外泌体-紫杉醇复合物的大小、稳定性、药物释放以及抗肿瘤效果进行了描述。研究者们还发现,对外泌体的膜结构进行超声处理会提高外泌体的最大药物承载量并有持续的药物释放。重要的是,外泌体包被紫杉醇会对耐药细胞系 MDCK MDR1 (Pgp+) 增加超过50倍的细胞毒性。然后,该研究在小鼠 Lewis 肺癌转移模型中发现该运载外泌体与肿瘤细胞有几乎完全的共定位,并在小鼠模型中有潜在的抗肿瘤效应。因此,研究者得出结论,利用外泌体运载紫杉醇(exoPTX)的方法,可能对各种耐药肿瘤细胞有着很好的潜在化疗效果。

1、外泌体 PTX 载药步骤

Exosomes:RAW 264.7,ExoQuick-TC™ Kit (SBI)

为了将 PTX 和 DOX 加载到外泌体中,首先将纯化的外泌体(〜10^11外泌体)与 PTX 或 DOX 在 1 mL PBS 中混合。研究了不同的载药方法:在室温下孵育(RT),电穿孔和超声处理。

温育方法:将混合物在 37℃ 摇动温育 1 小时。

电穿孔方法:将外泌体与 PTX 混合,并添加到冷却的 4 mm 电穿孔比色杯中。然后使用 Eppendorf Eporator 在 1000 kV 下电穿孔混合物 5 ms,然后在 37°C 温育 30 分钟以恢复外泌体膜。

超声处理方法:使用具有 0.25 英寸尖端的声波消解器对 PTX-外泌体或 DOX-外泌体混合物进行超声,其设置如下:20% 振幅,6 个周期的 30 s 开/关 3 分钟,每 2 个周期之间的冷却时间为 1 分钟。超声处理后,将 exoPTX 或 exoDOX 溶液在 37°C 下孵育 60 分钟,恢复外泌体膜。通过尺寸排阻色谱从 exoPTX 或 exoDOX 中分离出多余的药物。

通过高效液相色谱(HPLC)方法测量装载到外泌体中的 PTX 量。为了测量 PTX 释放,将新鲜制备的 exoPTX 放在设备中,然后将该装置在室温下在室温下在搅拌下置于 PBS 中。从透析管内部的时间点采集样品,并通过 HPLC 进行分析。从 exoPTX 释放的 PTX 量表示为总 PTX 的百分比,并绘制为时间的函数。

2、PTX 外泌体制剂的表征结果

图1. PTX外泌体制剂的表征

A: NTA. B: cells (1), naïve (2) and sonicated exosomes (3). C: 外泌体膜的微粘度:naïve exosomes (1); exosomes subjected to one sonication cycle (2);six cycles of ultrasound treatment(3); sonicated exosomes after 30 min incubation at 37°C(4); sonicated exosomes following one hour incubation period at 37°C(5). D: AFM(原子力显微镜). E: 外泌体释放PTX曲线

补图1.通过HPLC评估掺入外泌体的PTX量

The typical HPLC profile for PTX extracted from exosomes (B) and PTX standards (A) .

3、外泌体和外泌体结合的 PTX 在癌细胞中的积累

为了定量细胞摄取的外泌体的数量,如前所述,用亲脂性荧光染料 DIL 对外泌体进行染色。然后,以相等的数量(〜10^8个颗粒/孔)添加 DIL 标记的外泌体或荧光标记的脂质体或聚苯 yi 烯纳米颗粒(NP),并在 37℃ 和 5%CO2 下与 3LL-M27 细胞一起孵育不同时间。在每个时间点之后,除去培养基,并用 PBS 洗涤细胞 3 次,并通过与 Formal-Fixx 孵育进行固定,并通过共聚焦显微镜或使用 Shimadzu RF5000 荧光分光光度计进行检查。如果使用 exoPTX 或紫杉酚,则将等摩尔量的药物加入 MDCK WT 或 MDCK MDR1 细胞中,孵育72小时。然后裂解细胞悬浮液,并如上所述通过 HPLC 分析 PTX 含量。

图2.外泌体在3LL-M27细胞中的大量积累

补图 2. exoPTX 制剂的稳定性

从 Raw 264.7 巨噬细胞释放的外泌体加载 PTX,并在一个月的时间内分别在 4°C,室温和 37°C 下测量纳米颗粒的大小,都没有发现 exoPTX 尺寸的明显变化。

4、不同 PTX 制剂在癌细胞中的细胞毒性

表 1.不同 PTX 制剂在癌细胞中的细胞毒性

补图 3.在体外癌细胞系中空的超声处理的外泌体没有细胞毒性作用

5、exoPTX 细胞毒性作用的机理研究

假设 exoPTX 可能比 Taxol 更有效地改变药物的细胞内运输并绕过药物外排系统(特别是 exoPTX 可能促进 PTX 从癌细胞外泌体的内体释放)。检测掺入 MDCK MDR1 和 MDCK WT 细胞外泌体(exoDox)中的荧光探针和 Pgp 底物 Dox 的积累水平。通过 WB 证实了 MDCK MDR1 细胞中 Pgp 表达水平升高(图 3A)。在存在 / 不存在 Pgp 抑制剂维拉帕米的情况下,比较了游离 Dox 和掺入外泌体的药物 exoDox 的摄取。将 Dox 掺入外泌体显著提高了敏感性和耐药性癌细胞中的药物蓄积水平(图 3B)。维拉帕米抑制 Pgp 介导的药物流出增加了耐药性 MDCK MDR1 细胞中游离 Dox 的积累,但没有改变其敏感对应物中的药物积累。维拉帕米治疗不影响耐药性 MDCK MDR1 细胞中 exoDox 的积累,表明药物掺入外泌体使其绕过了这种耐药机制(图 3B)。

将 Pgp 底物(例如 R123 或 Dox)掺入基于嵌段共聚物的纳米载体(即 Pluronic 胶束)中,由于掺入膜中的 Pluronic 大分子抑制了 Pgp 外排转运蛋白,从而增加了耐药性癌细胞中的药物积累,抗性癌细胞的数量。为了排除外泌体通过与细胞膜融合抑制外泌体介导的 Pgp 介导外排的可能性,评估了 R123 在耐药性和敏感性 MDCK 癌细胞中的积累。在室温下孵育时,R123 不会掺入外泌体(补充图 4)。为此,先用 Pgp 抑制剂,维拉帕米(阳性对照)或空的外泌体或培养基(阴性对照)预处理 MDCK WT 和 MDCK MDR1 细胞单层,然后用 R123 溶液处理 2 小时(补充图 5)。在维拉帕米预处理的细胞中,耐药的 MDCK MDR1 细胞中的 R123 积累水平提高了近五倍。相反,用空的外泌体处理不会影响 MDCK MDR1 细胞中 R123 的积累(补充图 5)。用维拉帕米或空的外泌体都不能改变敏感的 MDCK WT 细胞中的 R123 积累水平。这表明外泌体对 Pgp 介导的外排没有任何抑制作用。

图 3. Pgp 抑制对 MDR 和敏感癌细胞中 Dox 积累的影响

在细胞裂解液中研究了 MDCK MDR1 和 MDCK WT 细胞中游离 Dox 或 exoDox 的积累。 Dox 掺入外泌体显著增加了敏感和耐药细胞中的积累,而在两种细胞系中均未发现维拉帕米对 exoDOX 积累的影响。

补图 4. 在室温下孵育时,R123 不会掺入外泌体

游离 R123 的释放时间比外泌体的释放时间晚得多。

补图 5.外泌体不抑制抗性癌细胞中 Pgp 介导的药物外流

维拉帕米显著增加了抗性癌细胞中 R123 的积累,并且没有改变敏感 MDCK WT 细胞中 R123 的吸收。与维拉帕米相反,外泌体预处理不影响 R123in 耐药 MDCK MDR1 细胞的蓄积水平,表明外泌体本身并不抑制 Pgp 外排机制。

6、外泌体在具有肺转移的小鼠中的生物分布

慢病毒载体(LV)的生产和 LLC 细胞的转导:构建了编码光学报告基因 mCherry(GBM8FlmC,红色)和萤火虫荧光素酶(FLuc)融合体的慢病毒载体 LV-mCherryFLu,转染 3LL-M27 细胞,构建稳转细胞株 8FlmC-FLuc-3LL-M27,用于生物分布和治疗功效研究。

八周大的雌性 C57BL / 6 小鼠,尾静脉注入 8FlmC-FLuc-3LL-M27 细胞(5×10^6 细胞 / 小鼠),建立肿瘤肺转移。注射 12 天后,将从巨噬细胞分离的 DID 标记外泌体经鼻内给药(即 10^7 颗粒 / 10μl×2)给患有肺转移的小鼠。四小时后,处死小鼠,灌注,取肺,切片,染色,通过共聚焦荧光显微镜观察。

补图 6. Lewis 肺癌(3LL-M27)的肺转移模型

在荷瘤肺(A)和肺切片(B)的 HE 图上检测到多个转移(箭头)。

图 4.气管输送的 exoPTX 与肺转移瘤的共定位

共聚焦图像显示外泌体与肺癌转移细胞几乎完全共定位(黄色)。 ×10(A)和×60(B)放大。

补图 7.气道输送的exoDox与肺转移瘤的共定位

共聚焦图像显示外泌体递送的 Dox 与转移灶显着共定位(黄色,C)。

7、exoPTX 对肺转移的治疗功效

在小鼠的肺转移模型中评估 exoPTX 的抗肿瘤作用:将 C57BL / 6 小鼠静脉内注射 8FlmC-FLuc-3LL-M27 癌细胞(5×10^6 细胞 / 100μL / 小鼠)。 48 小时后,对小鼠进行鼻内给药。每隔一天给 exoPTX(10^7 颗粒 / 10μl×2)或 Taxol(50 mg /kg/ 小鼠),共计 7 次。在治疗后 22 天对动物成像。化学发光信号通过 LivingImage®2.50 软件进行定量。为了评估第 22 天的癌症转移量,处死小鼠,进行灌注,通过共聚焦显微镜观察。